摘要

在活跃和废弃矿区土壤中生长的植物(Castanea sativa、Sambucus nigra、Verbascum thapsus、Popolus spp、Salix spp、pseudoplatanus Acer、Robinia pseudoacacia)的重金属分布具有科学意义，因为它可以识别它们在恶劣环境中的生存能力，并为植物修复操作提供有用的指示。在这项工作中，研究人员分析了意大利中部托斯卡纳地区Abbadia San Salvatore前汞矿区的土壤，分析了总汞、浸出汞、有机汞和无机汞的百分比。还测量了脱氢酶活性(DHA)，目的是评估土壤的状况，其特征是汞含量高(高达1068 mg kg - 1)。最后，还测定了在这些土壤中生长的植物不同部位的汞浓度。大多数研究土壤以无机汞为主(高达92%)，而DHA浓度< 151µg TPF g−1 day−1，这表明汞的存在对土壤酶活性没有显著影响。这也得到了生物积累因子(BF)的支持，其主要特征是值< 1。含硫量最高的是黑参和荆芥，分别为39.42和54.54 mg kg−1。植物叶片似乎是汞吸收的主要途径，在其他矿区也观察到，如almad (西班牙)，这表明颗粒汞和Hg0是进入植物系统的主要形式，后者是由放置焙烧炉的建筑物和土壤本身排放的GEM产生的。

介绍

自2011年以来，世界级的汞(Hg)矿区，以阿巴迪亚圣萨尔瓦多市(意大利托斯卡纳)为中心，位于Amiata山硅火山复群的东部(Conticelli et al.， 2004, 2015;Ferrari et al.， 1996;Laurenzi et al.， 2015)，一直在进行修复操作。自19世纪以来，Abbadia San Salvatore (ASS)一直是开采朱砂和生产液态汞的最重要地点之一。矿床确实被挖掘，干燥和烘烤，并通过冷凝系统生产液态汞。多年来，人们使用了不同的炉子:从木柴炉到斯派克-瑟马克炉，从古尔德太平洋炉到内萨炉。据估计，整个Amiata山的汞总产量中约有70%来自ASS (Cipriani & Tanelli, 1983)。ASS的采矿结构产生了超过10万吨的液态汞，其中约1万吨被分散到环境中(Bacci et al.， 2000;Vaselli et al.， 2015)。过去和最近对矿区及周边土壤、水和空气进行的地球化学调查(例如，Vaselli等人，2019年及其参考文献)强调，大多数环境基质的汞浓度远高于欧洲立法水平规定的水平。

Jiskra et al.(2018)和Zhou and Obrist(2021)认为，植被对大气汞的同化及其通过落叶树和凋落物向土壤和水中的转移是陆地生态系统中汞的主要来源。根据Higueras等人(2012)、Barquero等人(2019)和Naharro等人(2019)的研究，生长在富汞土壤上的植物倾向于吸收汞，因为汞通过气孔从土壤释放到大气中，而通过植物根系输送汞的可能性较小(Naharro等人，2019及其中的参考文献)。

一般来说，陆地环境中含汞有机形式的浓度至少比无机汞低一个数量级，尽管汞在食物网中的积累仍不清楚(Bailey等，2002;Zhang等人，2022)。土壤酶是土壤健康和质量变化的主要预警系统，可作为评估土壤健康状况的潜在生物指标(Datta et al.， 2021，参考文献)。在所有土壤酶中，脱氢酶(DHA)、碱性磷酸盐(ALP)和脲酶(UR)对潜在有毒元素(pte)和最小环境变化都很敏感(例如，Araujo et al.， 2015;Datta等人，2021;Elmayel et al.， 2020;Gallego et al.， 2021;Oliviera & Pampulha, 2006;Santos et al.， 2011)。特别是，DHA存在于所有活的微生物细胞中，因此，它被认为是土壤酶和微生物氧化活性的关键指标(Furtak & Gajda, 2017;Tan et al.， 2017;Wolinska & Stepniewska, 2012;Yuan & Yue, 2012)。根据Tazisong et al.(2012)和Mahbub et al.(2016)的研究，目前关于汞在植物中的生物学功能的信息很少。然而，该元素能够通过结合蛋白质的-SH残基和酶和蛋白质底物复合物的活性位点，或取代Ca或Mg等金属辅因子并改变这些化合物的结构来降低酶的活性(Mahbub等人，2016;Tazisong et al.， 2012)。在过去二十年中发表的大量科学调查(例如，Bacci et al.， 2000;Meloni et al.， 2021;Rimondi et al.， 2012, 2014a, 2014b a, b, 2015)关注Hg在空气、土壤、植被和水生隔室中的分布(例如，Chiarantini et al.， 2016, 2017;Ferrara et al.， 1998;Lazzaroni et al.， 2022;Vaselli et al.， 2013, 2015, 2021)。此前，在全球最著名的Hg区ASS矿区(Chiarantini等，2016)和almad (西班牙)矿区(例如，Barquero等，2019)开展的研究，调查了空气中Hg (Hg0)与维管植被之间的关系，以及土壤中DHA和Hg浓度之间的相互作用，证明土壤中高Hg含量不影响DHA (Campos等，2018)。Barquero等人(2019)和Chiarantini等人(2016)分别分析了黑松(Pinus Nigra)和松木(Pinus Pinea)科的松树。

本文介绍并讨论了土壤中汞的分布，以及原矿区最常见的植物及其部分(如根、干、叶)，以了解它们在哪个水平上受到高汞土壤含量的胁迫或对高汞土壤含量的抵抗。此外，本文还首次对土壤覆盖物中DHA酶与汞之间可能的相互作用进行了评价。

研究区域:ASS矿

ASS矿区位于当地城市中心的西北部。主要矿床为朱砂(HgS)，少量黄铁矿、黄铁矿、黄铁矿和雄黄(Rimondi et al.， 2015)。所有的开采都在地下，画廊达到地面以下400米(例如，Lazzaroni et al.， 2022)。汞的生产始于1899年，在伊特鲁里亚人和罗马人使用朱砂作为颜料后，该地区被遗弃了大约2000年(波提切利，2019;Fantoni et al.， 2022)。旧矿区包括一个大型木材矿床，用于旧炉，一些古老的烘干机，以及一些用于冷却通过冷凝器的气态汞的储罐。在接下来的几年里，安装了新的烘干机、皮带输送系统、水平(古尔德)和垂直(Nesa)炉，以及更高效的冷凝系统。1976年，由于开采汞在经济上不可持续，而且其使用变得明显有害和有毒，ASS的生产活动急剧放缓。1982年，整个采矿厂被彻底关闭。在20世纪90年代，ENI (Ente Nazionale Idrocarburi) -AGIP (Azienda Generale Italiana Petroli)单位提出了一个复垦项目，永久关闭以前的采矿和工业活动。2008年，阿斯ASS市政府与采矿特许权的前所有者(ENI-AGIP)签署了一项协议。采矿特许权和填海工程因此移交给公共行政部门。当地市政当局对ENI项目进行了全面修订，然后将填海作业用于矿区和博物馆和公用事业建筑的环境恢复(Vaselli等人，2019)。因此，整个采矿特许权被划分为7个不同的单元(图1a)，包括约65公顷的填海区(图1a中的黑色轮廓线):0区和1区是发现汞浓度低的地点;第2区和第3区分别是矿工和管理人员的建筑、采矿设备接地区、传送带和加里波第竖井，以及旧炉、干燥机和冷凝器;第4区，即“Le Lame”，由ASS矿区最重要的采矿垃圾场组成，占地面积为120,000平方米(例如，Meloni等人，2021和其中的参考文献);第五区包括军械库和守望者的房子;第6区是6个区中污染最严重的地区，拥有主要的关键采矿设施，例如Nesa和Gould炉，新旧干燥器，冷凝管系统，颜料制备大楼和液态汞收集罐(Vaselli等人，2017a)。

a ASS矿区填海面积(修改自Vaselli et al.， 2017)比例尺1:15.000。b第6区(研究区)插图，其中有收集土壤和植物的四个采样区。各区域土壤和植物样本的id列于补充资料表S1

ASS矿山的复建始于2013年，当时修建了旁路通道，以最大限度地减少雨水与汞污染土壤之间的水岩相互作用，并从屋顶上去除Eternit®(水泥和石棉纤维的混合物)(Vaselli等人，2015年)。补救工作仍在进行中，最近已开始清理第6区。为这项工作分析的所有土壤和植物样本都是在2018年2月从6区收集的，当时填海还没有开始。采样区域可分为:1)运输汞带(TMB)，靠近焙烧朱砂提取气态汞的炉;2)国民阵线(FN);3) Goroncino (GO)，储存来自当地和其他Amiata山汞矿的尾矿;4)Gould冷凝器(GC)，在焙烧过程后冷却气态汞(图1b)。

材料与方法

共采集了24种植物(8个不同种:木栗、黑参、毛蕊草、白杨、柳、假扁桃槭、刺槐和猪皮草)及其相关土壤。土壤取样深度在15至20厘米之间，以便分析根和土壤之间的总汞分布(Johnson et al.， 2005)。在采样日期的前两年，进行了一次完整的植被砍伐。这样，就知道了取样植物的年龄。决定将植物样品分为树皮、内外根、树皮和内树干、髓质(当树干或根出现时)和叶。表S1(补充材料)报告了WGS84-UTM 32N中的地理坐标、土壤id、采样位置、采样植物的拉丁名称以及每种植物被划分和分析的部分。对于每个植物样本，土壤颗粒都是手动刷掉的。随后，植物样品在超声波浴中洗涤，直到MilliQ水被清洁。然后，它们在35°C的烤箱中加热至少三天。最后，每一棵植物都用咖啡研磨机磨成小块。

土壤样品在35℃的烘箱中保存(以防止任何Hg0的损失)，直到干燥，然后在2 mm处过筛。小于2毫米的代表性样品(约100克)在配备玛瑙迫击炮和球的行星磨机(粉碎机5)中粉碎。使用多探针Hanna HI98194，按照UNI_EN 15933:2012标准测定每种土壤的pH值。

土壤和植物中的汞浓度由Lumex RA 915 +(塞曼效应原子吸收光谱法)仪器(Sholupov et al.， 2004)测定，该仪器配备了pyro915 +装置。此外，还估计了与有机(与腐植酸结合)和无机部分相关的汞的百分比(Rumayor等人，2016)。事实上，必须考虑到生物样品在275-290°C下燃烧。在这个温度区间内，所有与腐植酸化合物结合的汞都分解并释放出汞。仪器采用蒙大拿州土壤2710A进行校准，误差< 10%。

分析DHA的目的是量化土壤中有机活性的数量。配制0.15 mL蒸馏水、0.015 g CaCO3和0.25 mL 3% (m/V)的三苯四氮氯化铵(TTC, C19H15ClN4)的混合物，与1.5 g土壤反应。然后将样品放入37°C的培养箱中24小时(Casida et al.， 1964;Montejo et al.， 2012)，并最终在冰箱中冷却10分钟以停止反应。随后，加入5ml甲醇提取形成的TTC。在485 nm处用分子分光光度法测定有色提取物。所有这些分析都是在西班牙雷亚尔城的阿尔马德海姆的IGeA实验室(Castilla La Mancha大学Geología应用研究所)进行的。

在意大利里米尼(Rimini)的CSA实验室，采用USEPA 1312方法(USEPA, 1994)用ICP-MS测定了可溶汞，以模拟酸性矿井排水条件下可溶性汞的比例。这种提取需要将5克土壤样品与100毫升EPA溶液混合。将H2SO4和HNO3按60/40的比例加入到2l蒸馏水中，得到EPA溶液(pH为4.5±0.05)。将土壤与EPA溶液混合后，样品在搅拌恒温浴中以每分钟30转的速度加热18小时。加水以保持25°C的恒定温度。18 h后，使用孔径为0.45µm的玻璃纤维过滤器过滤样品。

所有统计计算(例如，最小值、最大值、平均值、Pearson相关性)都是用R和R studio完成的(R Core Team, 2021)，而所有图形都是用Origin 2021 b实现的。当化学数据低于定量限(LOQ) (Hg < 0.0005 mg kg - 1, BF < 0.001)时，它们被LOQ本身的2/3取代(Gozzi等人，2021)。

Hg生物积累因子(BF)

Campos等人(2018)认为，生物积累因子反映了汞在植物体内的生物利用度。生物积累因子(BF)是衡量pte从土壤到植物转移能力的参数(Wang et al.， 2016)。在本研究中，BF计算为植物不同部位Hg浓度与土壤可浸出Hg含量之比(式1):

（1）

其中Hgp是每个植物选定部分的汞浓度，而HgSL是可浸出汞含量，重新计算为浸出土壤的量。与其他元素不同，在这种情况下，BF通过间接方式表达元素的摄取。基本上，它可以指汞在被分析植物不同部位的吸收和生物积累。

目录

摘要
介绍
材料与方法
结果
讨论
结论
参考文献
致谢

作者信息
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补充信息


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结果

Hg公司表层土壤中DHA含量

表1总结了所研究土壤中pH值、总汞、浸出汞、土壤可浸出汞、%无机汞、%有机汞和DHA值的主要描述性统计数据(例如，观测次数、最小值、最大值、平均值、中位数、标准差)。完整数据集见表S2(补充资料)。

ASS矿区土壤的pH值以碱性为主。土壤中总汞的平均值为462 mg kg - 1，最小和最大浓度分别为2和1068 mg kg - 1。浸出土壤中汞的最低含量低于仪器检测限(样品ASS2为0.1 μ g L−1)，而最高浓度为20.4 μ g L−1(样品ASS14)，对应土壤可浸出汞为8.56 mg kg−1。除ASS1样品(无法测量相对百分比)外，土壤中无机汞和有机汞的百分比分别高达93.9%和73.5%。关于DHA，只有样品ASS2的浓度< 1µg TPF g−1 day−1，而最大值为166.0µg TPF g−1 day−1 (ASS8b)。

植物中的汞

在不区分不同植物部分的情况下，各研究区采集的8种植物中BF值的最小值、最大值和Hg浓度的最小值、最大值和中值汇总于表2。所有数据列在表S3(补充资料)中。

根据表2,Verbascum thapsus是汞含量最高的植物(54.54 mg kg - 1)，而含量最低的是pseudoplatanus (3.13 mg kg - 1)。就BF值而言，黑参(Sambucus nigra)和沙棘(Verbascum thapsus)是积累Hg量最高的两种植物物种(max。值BF分别为0.93和0.64)。其余植株的最大BF值< 0.60。

讨论

就土壤中总汞的分布而言，GC区结果是汞浓度最高的区域，其次是TMB > GO > FN(图1b)。总汞和淋溶汞之间没有显著的相关性，表明汞在土壤中的分布不均匀，可能与不同的来源有关。Campos等人(2018)报告了总汞与土壤浸出汞之间的相关性为0.79，土壤浸出汞与腐植酸汞之间的相关性为0.65，与此相反，在这项研究中，土壤浸出汞在分析的汞物种之间没有任何相关性。表层土壤确实受到人为物质的影响。过去，在前矿区的一些地区，包括收集土壤样本和植物的地点，焙烧后的材料和人为的人造材料(如砖、瓦、混凝土碎片)被用来填充位于Gould和Nesa熔炉所在的大厦前面的一个小古山谷(图1b) (Vaselli等人，2015)。

热形态数据证明，尽管8个表层土壤(即ASS3、ASS4、ASS10、ASS14、ASS17b、ASS18、ASS19和ASS20a)中有机相关汞的比例高于无机汞，但大多数汞是无机的，如图2的条形图所示。

土壤样品中有机和无机汞的柱状图

在这项研究中，以及在Almadenejos冶金区(西班牙almad ;Campos等人(2018)发现，总汞与热形态鉴定的组分(即与汞相关的腐植酸和无机汞)之间存在正相关关系(图3a、b和图4)。在图3a中，可以观察到两个明显的趋势。第一个趋势对应于总汞与有机汞的正相关，第二个趋势主要由ASS8a、ASS8b、ASS17a和ASS21四个样品描述，其特征是计算的无机汞浓度增加(高达> 80%)，而有机汞几乎保持不变。这可能意味着这些土壤样品可能表明存在较高含量的残余采矿物质。当不考虑这四个样本时，两个参数之间的相关性显著增加，Pearson系数为0.92(图3b)。当绘制总汞与无机相关汞的关系时，也得到了类似的正相关(r = 0.92)(图4)。这种相互依赖性表明，as矿山土壤中汞化合物的分选是一个独特的过程，不受样品的相对位置、存在的有机物量和酶活性的影响，Campos等人(2018)也报道过。值得注意的是，位于GO区的土壤样品(图1b和表S1)中有机汞含量高于靠近采矿设施的土壤样品，这表明靠近产生液态汞的机械会影响土壤基质。

有机相关汞与总汞(单位:mg kg−1)的二元图，有和没有采样ASS8a,b, ASS17a, ass21b。有机汞浓度是通过热形态计算得到的

无机相关汞与总汞的二元图(单位:mg kg−1)。无机汞的浓度是由热形态计算得到的

此外，可浸出汞(µg L−1)与有机相关汞(mg)之间的第二个相关性(r = 0.5)较弱。

kg−1)见图5。Campos等人(2018)认为，汞最不稳定的种类是那些含有有机汞的汞。然而，他们指出，高浓度的浸出汞(高达20 μ g L−1)也可以通过固相释放，并不一定只与有机汞有关。

浸出(µg L−1)和有机相关汞的对数尺度二值图。有机汞浓度是通过热形态形成计算得到的

测定的DHA含量平均值为53.7µg TPF g−1 day−1。这一数值明显低于Campos等人(2018)在Almadenejos土壤和Hinojosa等人(2004)对重金属污染土壤(平均:70µg TPF g−1 day−1)所测得的数值。

从采矿和生产区收集的土壤中DHA的浓度似乎甚至低于Hinojosa等人(2004年)在Aznalcollar矿区复垦场地(西班牙西南部)测量的浓度。根据Pan和Yu(2011)的研究，土壤中pte的存在会对酶活性产生负面影响，影响酶-底物络合或氨基酸的结构。在这种情况下，总汞与DHA酶图(图6)显示两个参数之间的散点分布相关性较差(Pearson相关r = 0.52, p < 0.05)，这表明汞的存在，独立于其形态，不会影响ASS土壤中的微生物活性，类似于Campos等人(2018)对Almadenejos富汞土壤的观察结果。

ASS矿区土壤中DHA (mg TPF g−1d−1)与Hg (mg kg−1)的散点图。蓝色圆圈:来自CG的样品，红色圆圈:来自FN的样品，青色圆圈:来自GO的样品，暗黄色圆圈:来自TMB的样品

考虑到通常在AAS矿床及周边含汞矿区发现的金属和类金属浓度(Meloni etal .， 2021;Rimondi等人，2014a)，分析光谱应扩大，以证明酶活性是否可能受到其他pte(如As和Sb)的危害。

植物中的汞和高炉

图7中的柱状图描述了除伪平槭(Acer pseudoplatanus)和柳树(Salix spp.)只采集了一个样本(分别为树皮、树干和根)外，各部分的汞分布情况。刺槐(Robinia pseudoacacia)、黑参(Sambucus nigra)、木栗(Castanea sativa)和白杨(Popolus sp .)的根和柳属(Salix sp .)的汞含量最高，而槭属(Acer)的树皮树干则富集汞。铜菖蒲(Cytisus scoparius)和荆芥(Verbascum thapsus)的表现不同，因为其叶片中汞含量较高。值得注意的是，汞浓度最高的是位于TMB区域的scoparius Cytisus叶片(图1)，该区域大气中的气态元素汞几乎一直高达50,000 ng m - 3甚至更高(Vaselli et al.， 2013)。

刺槐a、白杨b、荆芥c、黑参d、木栗e、猪皮草各分析部位汞含量柱状图(f)

这可能与以下事实有关:由于干沉积，叶片系统是汞吸收的主要途径之一(Chiarantini等人(2016)和Campos等人(2018)也提出了这一观点)，以及来自富汞环境的气态汞(例如在采矿机械和熔炉附近的空气中记录的汞)和来自土壤的弥漫汞，尽管目前没有可用的汞通量测量。

从GO采集的Verbascum thapsus叶片(与as17土壤有关)中检测到的高汞浓度(图1b)可以解释为ASS的主要风来自NNE/NE (https://www.meteoblue.com/it/tempo/historyclimate/climatemodelled/abbadia-san-salvatore_italia_3183581)，因此有利于富汞大气颗粒和大气Hg从TMB沉积到GO(图1b)。因此，根据本研究中分析的植物不同部位的调查(图7)，叶片可能是可用于ASS植物的主要吸氢机制，从而证实了先前的调查，例如Naharro等人，(2019)。有时，根似乎在吸收氢方面起作用。然而，对那些未采集叶片的植物的叶片器官进行进一步分析是必要的。

汞在外根和内根之间的分布情况见图8。所有研究的根样品都表明，与预期的一样，汞浓度在外根中增加，但黑参的外根/内比约为1.7，即比Hg含量> 20 mg kg - 1的样品低一个数量级以上。据我们所知，有关汞在内外根之间分配的研究很少，这需要更详细的调查。

植物样品外根中汞(mg kg - 1)与内根中汞(mg kg - 1)的双对数尺度散点图。植物名称前的数字对应相应的土壤(见表S1)

根据Hussain等人(2022)的研究，BF是一个模拟植物吸收pte能力的分配系数，在本研究中，它被应用于被分析植物各部分的汞浓度，以及与土壤可浸出汞相关的浓度。当考虑到不同的植物部门时，BF值变化很大(表S3)。BF值均< 1(表S3)，但黑参树皮干、树皮根和荆刺叶的BF值均> 0.6(分别为0.63、0.93和0.65)。Verbasum thapsus叶片的BF值似乎证实了叶片可能是植物吸收氢的主要途径。另一方面，黑树树皮干和树皮根的BF值较高，可能是由于在清洗过程中难以有效、彻底地去除所有与土壤有关的颗粒。这意味着根和树干最外层的汞浓度很可能受到土壤物质的影响。

结论

在这项研究中，研究人员调查了Abbadia San Salvatore前矿区土壤和植物中汞的分布，并据我们所知，首次在世界上最重要的汞产地之一确定了DHA浓度和BF值。位于高汞污染区6的土壤中汞的含量在收集植物的四个高汞污染区中呈非均匀分布(图1b)。在靠近Nesa和Gould熔炉的建筑附近测得最高浓度，因为在这里，当采矿活动活跃时，矿山尾矿和与采矿活动有关的人造材料被用来填满一个小的古山谷，可能增加了原始汞含量。除了8种土壤外，热形态允许认识到无机汞，可能与朱砂有关，是有机成分的主要物种。低DHA浓度表明该地区可能受到pte污染，尽管需要进行调查以证明其存在。然而，总汞和DHA之间的相关性虽低，但呈正相关，这表明汞化合物不会影响DHA的酶促作用，也不会抑制反而会增强微生物活性。研究植物体内汞浓度表明，叶片系统是吸收汞的主要途径。对于那些未分析叶片的样品，根系显然在汞的吸收中起重要作用。然而，需要更详细的调查来充分了解i)在富汞土壤环境中发育时对根系的影响以及ii)汞在内外根之间的分配。所有样品的BF值均< 1，表明土壤汞向植物的迁移较弱。为了避免在计算BF计算时可能出现的错误，建议对植物的不同部位(特别是与土壤接触最多的部位)进行更仔细和反复的洗涤。根据本研究，植物修复项目应考虑黑参吸收汞的能力，在修复区域内的安全处置地点建立一个由黑参人工林组成的试验点，以验证去除汞是否有效。尽管如此，我们还是建议对更多的本土植物进行深入的分析，以验证其他物种是否具有比Sambucus nigra更强的汞吸附能力。

补充信息

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